Pengaruh Sumber Nitrogen, Jenis Medium dan Waktu Inkubasi Terhadap Pertumbuhan dan Produksi Antibiotik dari Bacillus cereus yang diisolasi dari Pantai Mentigi

 Berikut ini merupakan Skripsi saya untuk menyelesaikan studi S1 di Program Studi Biologi Universitas Mataram. Karena skripsinya kebanyakan, jadi saya cuma taruh intisarinya aja (kalo taruh skripsinya bisa capek bacanya,hehehe)

Pengaruh Sumber Nitrogen, Jenis Medium dan Waktu Inkubasi Terhadap Pertumbuhan dan Produksi Antibiotik dari Bacillus cereus yang diisolasi dari Pantai Mentigi

oleh

Dede Bogel

Semakin meningkatnya kasus resistensi terhadap antibiotik yang diproduksi oleh Bacillus dari lingkungan darat, menyebabkan pencarian sumber antibotik dari lingkungan perairan gencar dilakukan dalam beberapa dekade ini. Isolat Bacillus cereus dari pantai Mentigi terbukti memiliki potensi antibiotik yang cukup bagus berdasarkna skrening awal dengan menggunakan metode overlay. Akan tetapi, produksi antibotik pada medium padat relatif kurang efisien jika dilihat dari pertumbuhan bakteri penghasil dan juga kemudahan isolasi antibotik yang dihasilkannya. Oleh karena itu produksi antibotik akan lebih efisien jika digunakan medium cair dalam proses fermentasi. Fermentasi Bacillus cereus memerlukan optimalisasi jenis medium dan nutrisi. Peneltian ini bertujuan: untuk mengetahui pertumbuhan, dinamika populasi dan produksi antibiotik isolat Bacillus cereus pada berbagai jenis medium fermentasi dan sumber nitrogen serta keterkaitan antara pertumbuhan Bacillus cereus terhadap produksi antibotiknya. Percobaan ditata dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan Percobaan Faktorial yang terdiri dari 3 faktor, yaitu: faktor 1: jenis medium: (NBS dan, SAQ), faktor 2: sumber N (tanpa N, NH₄Cl, asam glutamat), faktor 3: waktu inkubasi (4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 dan 48 jam). Kultur starter diinkubasi 16 jam pada medium NB kemudian diinokulaiskan pada medium fermentasi sesuai dengan kombinasi perlakuan. Selama proses fermentasi berlangsung, diamati pertumbuhan bakteri (yang dilakukan dengan metode Viable Plate Count dan Turbidimetri) dan pemanenan antibiotik sesuai dengan perlakuan waktu inkubasi. Antibiotik yang telah dipisahkan dari kultur sel melalui sentrifugasi selanjutnya diuji daya hambatnya terhadap bakteri uji yang terdiri dari 3 bakteri gram positif (Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Streptococcus viridans) dan 3 bakteri gram negatif (Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli). Signifikasi diameter zona hambat pada kultur bakteri uji dianalisis dengan ANOVA taraf 0,05 dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Jujur (BNJ) serta analisis korelasi. Selain itu dilakukan pula analisis statistik deeskriptif dengan membuat kurva tumbuh berdasarkan data Log CFU (Coloni Forming Unit), OD (Optical Density) serta pendekatan regresi dari tiap kurva tumbuh. Pada tiap kombinasi medium fermentasi, isolat Bacillus cereus mencapai fasa adaptasi pada 0-8 jam, fasa eksponensial antara 8 – 20 jam dan fasa stasioner pada waktu inkubasi 24 jam. Tanpa adanya sumber N tambahan, baik pada medium NBS (Nutrien Broth Tersuplementasi) dan SAQ (Aquades + Suplemen) terjadi penurunan jumlah sel yang drastis dari Bacillus cereus pada waktu inkubasi > 36 jam, sedangkan dengan penambahan sumber N, pertumbuhan Bacillus cereus pada waktu inkubasi > 36 jam relatif lebih stabil. Zona hambat tertinggi dihasilkan oleh supernatan isolat Bacillus cereus yang dikultur pada medium dengan sumber N asam glutamat dengan waktu inkubasi 24 jam. Sementara itu tidak terjadi perbedaan zona hambat supernatan Bacillus cereus yang dikultur pada medium SAQ dan NBS. Supernatan isolat Bacillus cereus pada semua kombinasi medium fermentasi menunjukkan zona hambat tertinggi terhadap bakteri uji Bacillus cereus (gram +) dan Proteus mirabilis (gram -). Pertumbuhan isolat Bacillus cereus sedimen pantai pada berbagai kombinasi medium menunjukkan korelasi tertinggi terhadap zona hambat yang dihasilkannya terhadap bakteri uji Bacillus cereus isolat klinis. Untuk penelitian selanjutnya, disarankan perlu dilakukan penambahan jenis sumber N, variasi jenis medium dan juga waktu inkubasi lebih dari 48 jam untuk optimalisasi produksi antibiotik dari Bacillus cereus dengan menggunakan bakteri uji Bacillus cereus dan Proteus mirabilis isolat klinis serta perlu dilakukan isolasi dan karakterisasi sederhana metabolit yang dihasilkan oleh Bacillus cereus sedimen pantai

karakteristik dan potensi antibiotik Bacillus cereus

A.    Ciri Umum Kelompok Bacillus

Secara umum, Kelompok Bacillus merupakan bakteri berbentuk batang (basil), dan tergolong dalam bakteri gram positif yang umumnya tumbuh pada medium yang mengandung oksigen (bersifat aerobik) sehingga dikenal pula dengan istilah aerobic sporeformers. Kebanyakan anggota genus Bacillus dapat membentuk endospora yang dibentuk secara intraseluler sebagai respon terhadap kondisi lingkungan yang kurang menguntungkan, oleh karena itu anggota genus Bacillus memiliki toleransi yang tinggi terhadap kondisi lingkungan yang berubah-ubah

Beberapa anggota Bacillus memiliki S-layer yang merupakan lapisan crystalline dipermukaan subunit protein atau glikoprotein. Bagian kapsul kebanyakan anggota Bacillus mengandung D atau L-glutamic acid, sedangkan beberapa lainnya memiliki kapsul yang mengandung karbohidrat. Variasi struktur dinding sel seperti pada kebanyakan bakteri gram negatif tidak ditemukan pada genus Bacillus. Dinding sel vegetatif kebanyakan anggota Bacillus terbuat dari peptidoglikan yang mengandung Meso-Diaminopimelic acid (DAP) dengan tipe Glyserol Teichoic Acid sangat bervariasi diantara spesies. Kebanyakan anggota genus Bacillus merupakan bakteri yang bersifat motil dan memiliki flagela tipe peritrik.

B.     Karakteristik Bacillus cereus

Bacillus cereus merupakan salah satu anggota genus Bacillus yang pertama kali diisolasi pada tahun 1969 dari darah dan cairan pleura pasien pneumonia. Bacillus cereus memiliki beberapa karakter morfologi diantaranya: gram positif dengan lebar sel 0,9 – 1,2 µm dan panjang 3 – 5 µm.  motilitas positif, spora elipsoidal, sentral atau parasentral, spora jarang keluar dari sporangia. Tidak membentuk kapsul, biasanya muncul dalam bentuk rantai panjang tipe R. Bentuk koloni irregular, opague terkadang waxy. Pada medium cair membentuk turbiditas moderate

Sel vegetatif dari Bacillus cereus dapat tumbuh pada rentang temperatur 5– 50 ^oC dengan temperatur optimal antara 35 - 40 ^oC, resisten terhadap pH 4,5–9,3. Dapat tumbuh pada anaerobic agar dan nutrien broth dan penambahan NaCl 7%, nutritive agar serta nutritive agar dengan 7 – 10 % darah domba. Waktu generasi relatif singkat, antara 20 – 30 menit. Dalam medium GA, Bacillus cereus telah mencapai fase eksponensial pada 6 jam inkubasi dan mencapai fase stasioner 20 jam setelah inkubasi.

Bacillus cereus memiliki karakter yang mirip dengan Bacillus thuringiensis dan Bacillus anthracis, namun tetap dapat dibedakan berdasarkan determinasi motilitas (kebanyakan Bacillus cereus bersifat motil) dan adanya kristal toxin (hanya dihasilkan oleh B. thuringiensis), aktivitas hemolisis (B cereus memiliki sifat ini, sedangkan B. anthracis bersifat non-hemolitik).

Beberapa strain dari Bacillus cereus bersifat patogen dan berbahaya bagi manusia karena dapat menyebabkan foodborne illness, namun beberapa diantaranya yang bersifat saprofitik dapat bermanfaat sebagai probiotik dan juga penghasil antibiotik yang potensial. Bacillus cereus kebanyakan ditemukan terkandung dalam bahan pangan dan menyebabkan 2 tipe keracunan makanan: 1) emetic yang merupakan keracunan yang dimediasi oleh toksin yang sangat stabil yang dapat bertahan pada temperatur tinggi, pH ekstrim serta tahan terhadap enzim pencernaan seperti: trypsin, pepsin. 2) diarrhoeal yang dimediasi oleh enterotoksin yang labil terhadap panas dan asam. Bacillus cereus merupakan mikroorganisme yang dapat tumbuh pada kisaran temperatur yang luas dan terdapat strain yang tergolong psychrophilic hingga thermophilic. Karena kebanyakan strain Bacillus cereus hidup dalam gastro-intestinal dan menyebabkan infeksi diarrhoeal, maka temperatur 37^oC merupakan temperatur pertumbuhan yang optimal.

C.     Potensi Produksi Antibiotik Bacillus cereus

Beberapa species utama genus Bacillus yang dapat memproduksi peptida antibiotik diantaranya: Bacillus brevis (contoh: Gramicidin, Tyrothricin), Bacillus cereus (Cerexin, Zwitermicin), Bacillus circulans (contoh: Circulin) , Bacillus laterosporus (contoh: Laterosporin). Bacillus licheniformis (contoh: Bacitracin), Bacillus polymyxa (Polymixin, Colistin), Bacillus pumilus (contoh: Pumilin) dan Bacillus subtilis (Difficidin, Subtilin, Mycobacillin).

Bacillus cereus merupakan salah satu anggota genus Bacillus yang memiliki potensi antibiotik. Bacillus cereus memproduksi Biocercin yang efektif menghambat Staphylococcus aureus dan Staphylococcus albus dengan menggunakan protease pepton agar sebagai medium uji. Spesies ini diketahui bersifat antagonistik terhadap Fusarium roseum var sambucinum yang merupakan agen penyebab Potato Dry Root dengan menggunakan medium uji potato dextrose agar.

Bacillus cereus memproduksi Mycocercin yang merupakan antibiotik peptida yang efektif terhadap beberapa jenis yeast maupun mold dengan rentang minimal inhibitory concentration antara 19,5 – 78 mikrogram/mL. Cerexin B merupakan antibiotik yang efektif terhadap bakteri gram positif yang diproduksi oleh Bacillus cereus Gp-3 dan merupakan antibiotik amphoteric acylpeptide. Bacillus cereus BMG 366-UF5 melalui fermentasi dengan menggunakan spora sebagai inokulum awal, dapat memproduksi Prumycin yang merupakan antibiotik yang juga diproduksi oleh Streptomyces kagawaensis dengan aktivitas yang tidak jauh berbeda.

Zwittermicin A merupakan salah satu antibiotik golongan aminopolylol yang diketahui efektif dalam menghambat beberapa patogen yang menyerang tanaman dengan spektrum luas meliputi bakteri (baik gram positif maupun gram negatif), beberapa fungi (seperti: oomycetes) dan protista (contohnya: alga). Zwittermicin A diketahui diproduksi oleh beberapa strain Bacillus cereus diantaranya: Bacillus cereus UW 11, UW 32, UW 52, UW 56, UW 64, UW 78, UW 89, UW 96,UW 119 dan UW 120. Beberapa strain tersebut selain memproduksi Zwittermycin A, juga memproduksi Kanosamin yang merupakan antibiotik dengan spektrum luas.

Reference

ABIS encyclopedia, 2009. Bacillus  cereus. http://www.tgw1916.net/ABIS/ encyclopedia. html. diakses: 20 Februari 2010.

Buda. G. 2009. Bacillus Cereus. http://wvlc.uwaterloo.ca/biology447/assign 2000/buda/ assignment2.htm . diakses: 20 Februari 2010.

Food and Drugs Association, 2001 . Bacillus cereus and another Bacillus spp. http://www.fda.gov/Food/FoodSafety/FoodborneIllness/FoodborneIlln. diakses: 5 November 2009.

Hoffmaster. A. R., R. T. Novak, C. K. Marston, J. E. Gee, L. H., J. M. Pruckler and P. P Wilkins. Genetic Diversity of clinical isolates of Bacillus cereus using multilocus sequence typing. BMC Microbiology 2008, 8:191.

Jenson I and Moir CJ. (1997) Bacillus cereus and other Bacillus species. In: Foodborne microorganisms of public health importance, 5th Edition, (Eds) Hocking, A.D., Arnold, G., Jenson, I., Newton, K. and Sutherland, P. pp 379-406. AIFST (NSW Branch), Sydney, Australia.

Milner. J. L., E. A. Stohl, J. Handelsman. 1996a. Zwittermicin A Resistance Gene from Bacillus cereus. Journal Of Bacteriology, p. 4266–4272 Vol. 178, No. 14.

Milner. J. L., L. silo-suh, J. C. Lee, H. he, J. Clardy, J. Handelsman. 1996b. Production of Kanosamine by Bacillus cereus UW 85. Applied and environmental microbiology, p. 3061–3065 vol. 62, no. 8.

NCBI, 2000. Bacillus Cerus. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db= genomeprj& cmd=ShowDetailView&TermToSearch=19959. Diakses 30 Maret 2010.

Sadfi. N., M. Cherif, M. R. Hajlaoui, A. Boudabbous, R. Belanger. 2002. Isolation and Partial Purification of Antifungal Metabolites Produced by Bacillus cereus. Ann Microbiol., 52, 323 – 337.

Todar. K. 2009. Bacillus and Related Endospore-forming Bacteria. http://www. textbookof bacteriology.net/Bacillus.html. diakses: 6 Nopember 2009.

Wijnands. L. M., J. B. Dufrenne, F. M van Leusden. Bacillus cereus: characteristics, behaviour in the gastro-intestinal tract, and interaction with Caco-2 cells. RIVM report 250912003.

Penggolongan dan Mekanisme Produksi Antibiotik

A.  Definisi dan Penggolongan Antibiotik

Kata antibiotik berasal dari kata ’antibiosis’  yang berarti anti kehidupan. Terminologi ini pertama kali diperkenalkan oleh Vuillemin untuk menjelaskan fenomena daya hambat dari metabolit tersebut. Selanjutnya, istilah antibiosis diganti menjadi antibiotik dan diperkenalkan pertama kali pada tahun 1942 oleh Selman Waksman yang merupakan ahli mikrobiologi dari Amerika Serikat. Secara teoritis, pengertian antibiotik adalah agen antimikrobial yang diproduksi oleh mikroorganisme tertentu yang dapat membunuh ataupun menghambat pertumbuhan mikroorganisme lainnya. secara spesifik, sebenarnya istilah antibiotik lebih mengacu pada antibakteri karena pada awalnya antibiotik memang digunakan untuk treatment terhadap infeksi penyakit yang disebabkan oleh bakteri.

antibiotik dapat digolongkan menjadi beberapa jenis tergantung dari segi apa kita melihatnya. berdasarkan kemampuannya dalam treatment patogen, Antibiotik dapat digolongkan menjadi atnibiotik yang bersifat statik (bakteriostatik) maupun sidal (bakteriosidal). Sifat Bakteriostatik merupakan sifat yang dapat menghambat multiplikasi bakteri sehingga dapat menghambat pertumbuhannya. Sifat bakteriosidal merupakan istilah spesifik untuk antibiotik yang dapat membunuh bakteri.  Mekanisme bakteriosidal berbeda dengan bakteriostatik hanya dalam sifat irreversibelitasnya. penentuan sifat apakah suatu antibiotik tergolong bakteriostatik ataupun bakteriosidal umumnya dapat dilakukan dengan uji sederhana menggunakan metode turbidimetri.

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antibiotik (terutama sebagai treatmen terhadap infeksi bakteri) dapat digolongkan menjadi antibiotik yang menghambat sintesis dinding sel (misalnya Penicilin, Cephalosporins), menghambat sintesis  membran sel (contoh: Polymixin), mempengaruhi enzim esensial bakteri (contoh: Quninolones, Sulfonamides). Biasanya, secara natural, antibiotik yang memiliki mekanisme kerja seperti ini merupakan antibiotik yang bersifat bakteriosidal. Beberapa antibiotik mempunyai mekanisme kerja dengan menghambat sintesis protein (contoh: Aminoglycosida, Macrolida dan Tetracycline) umumnya bersifat bakteriostatik

Berdasarkan luas (skope) pengaruh daya kerjanya, antibiotik dapat dibedakan menjadi antibiotik spektrum luas dan antibiotik spektrum sempit. Antibiotik spektrum luas memiliki daya hambat yang luas dan dapat dijadikan sebagai treatment terhadap bakteri gram positif maupun gram negatif, begitu pula terhadap bakteri basil, kokus maupun spiral. Antibiotik spektrum sempit memiliki daya hambat yang sempit, yaitu hanya menghambat mikroorganisme jenis tertentu saja secara spesifik. Sebagai contoh: terdapat antbiotik yang hanya efektif terhadap gram negatif, hanya efektif terhadap gram positif, hanya efektif terhadap fungi maupun protozoa.

Berdasarkan susunan kimianya, antibiotik digolongkan menjadi: 1) metabolisme asam amino, diantaranya Penicilin dan turunannya, Chepalosporin dan turunannya, Chloramphenicol dan turunannya, Lincomycin dan turunannya, Cycloserine, Dactiomycine dan antibiotik golongan peptida. 2) metabolisme asam asetat, diantaranya: Tetracycline dan turunanannya, Antineoplastik, Anthracycline, antibiotik Macrolide, antibiotik Polien. 3) metabolisme karbohidrat, diantaranya: Streptomycin, Paramomycin, Kanamycin, Gentamycin, Tobramycin, Amicacin dan Spectinomycin. (Todar, 2000)

B.  Produksi Antibiotik

Antibiotik umumnya merupakan metabolit sekunder yang diproduksi oleh mikroorganisme tertentu pada idiofase atau fase stasioner. Antibiotik sifatnya khas dan spesifik artinya tiap mikroorganisme tertentu memproduksi antibiotik tertentu pula. Dalam hal ini, produksi antibiotik amat dipengaruhi oleh faktor genetik. Produksi antibiotik baru maupun peningkatan efektivitas antibiotik yang dihasilkan oleh mikoorganisme tertentu dapat dilakukan dengan modifikasi gen untuk menciptakan strain yang mampu memproduksi antibiotik jenis baru. Selain itu modifikasi susunan kimia metabolit hasil fermentasi juga merupakan salah satu teknik untuk memproduksi antibiotik jenis baru. Secara umum, produksi antibiotik dapat dilakukan dengan cara fermentasi maupun dengan modifikasi susunan kimia metabolit hasil fermentasi.

Produksi antibiotik oleh mikroorganisme melalui serangkaian jalur biosintesis yang rumit, dan sangat bervariasi tergantung dari kelas antibiotik yang diproduksi. Namun, secara umum antibiotik diproduksi oleh mikroorganisme tertentu melalui dua jalur biosintesis. Yaitu jalur biosintesis polyketida yang identik dengan jalur sintesis asam lemak dan jalur biosintesis nonribosomal peptide, yang merupakan serangkaian tahap elongasi asam amino tertentu untuk membentuk rantai popipeptida dengan panjang dan urutan tertentu. Kebanyakan antibiotik yang ada saat ini diproduksi melalui jalur biosintesis polyketida. jalur biosintesis non-ribosomal peptida merupakan jalur biosintesis unik yang belakangan ini banyak diteliti terutama oleh para ahli biokimia. antibiotik yang diproduksi melalui jalur biosintesis ini kebanyakakn merupakan antibotik golongan polipeptida (asam amino). jalur biosintesis ini dikatakan unik karena meskipun produk akhirnya polipeptida, namun sintesis antibiotik melalui jalur ini tidak terjadi pada ribososom (seperti yang kita ketahui, ribosom merupakan organel tempat terjadinya sintesis protein) melainkan secara langsung dikatalis oleh enzim Non-Ribosomal Peptide Syntetase (NRPS).

Reference

Brooks, G. F., J. S. Butel, S. A. 2001. Mikrobiologi Kedokteran. Salemba medika. Jakarta.

Glazer. N. A., dan H. Nikaido. 2008. Microbial Biotechnology Fundamentals of Applied Microbiology. http://www.cambridge.org/9780521842105. diakses: 12 Desember 2009.

Sawan. S. P. and G. Manivannan. 2000. Antimicrobial/Anti-infective Material. Principle, applications and device. New Delhi.
 
Todar. K. 2000. Antibiotic. http://lecturer.ukdw/ichira/antibiotic.html. diakses: 23 Desember 2009.

Waluyo, L. 2008. Teknik Metode Dasar dalam Mirkrobiologi. UPT Penerbitan Universitas Muhamadiyah Malang. Malang.

Wienar, P., 1996. Experimental studies on the ecological antibiotic production in bacteria. Evolutionary Ecology 1996, 10, 405-421.